เมนูย่อย

หน้าแรก องค์ความรู้ การจัดการองค์ความรู้ การพัฒนาวิธีผลิตวัคซีนอหิวาต์สุกรโดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยง

การพัฒนาวิธีผลิตวัคซีนอหิวาต์สุกรโดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยง

โดย สัตวแพทย์หญิงวาสนา ภิญโญชนม์ ผู้เชี่ยวชาญด้านวิจัยโรคสัตว์เล็กและสัตว์ใหญ่ กรมปศุสัตว์

          การ ผลิตวัคซีนอหิวาต์สุกร (Swine fever vaccine) ของกรมปศุสัตว์ โดยสำนักเทคโนโลยีชีวภัณฑ์สัตว์ เป็นวัคซีนชนิดดูดแห้ง เสตรนไชนีส เตรียมจากกระต่ายโดยการฉีดเชื้อไวรัสวัคซีน เข้าเส้นเลือดกระต่าย เก็บม้าม ต่อมน้ำเหลือง และเลือด นำมาบดรวมกันเป็นวัคซีน วิธีดังกล่าวต้องใช้กระต่ายปีละหลายพันตัว กรรมวิธีการผลิตและการหาปริมาณเชื้อไวรัสวัคซีนมีหลายขั้นตอนและยุ่งยาก การผลิตอหิวาต์สกรของประเทศญี่ปุ่นใช้เชื้อวัคซีนมีหลายขั้นตอนและยุ่งยาก การผลิตอหิวาห์สุกรของประเทศญี่ปุ่นใช้เชื้อวัคซีนสเตรน GPE เพาะเลี้ยงในเซลล์ไลน์ FS -L3 ซึ่งเป็นเซลล์ที่เพาะเลี้ยงได้ต่อเนื่อง และเก็บเป็นสต็อกในถังไนโตรเจนเหลวงเป็นเวลานาน สะดวกในการใช้ นากจากนี้การเจริญของเซลล์ชนิดนี้ไม่ต้องการซีรัม ซึ่งจะทำให้ประหยัดต้นทุนการผลิต กรรมวิธีการผลิตและการหาปริมาณของเชื้อไวรัสวัคซีนสามารถทำได้ในห้องปฏิบัติ การโดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยงเป็นการพัฒนาวิธีการผลิตวัคซีนอหิวาห์สุกรชนิดใหม่ ที่ได้มาตรฐานสากลสามารถนำไปประยุกต์ผลิตในระดับอุตสาหกรรมได้ สัตวแพทย์หญิงวาสนา ภิญโญชนม์ และคณะ กลุ่มไวรัสวิทยา สถาบันสุขภาพสัตว์แห่งชาติ ร่วมกับนักวิจัยจากจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ได้ดำเนินการวิจัยพัฒนาวิธีผลิตวัคซีนอหิวาต์สุกรโดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยงโดย ได้รับงบประมาณสนับสนุนจากกรมปศุสัตว์ และสภาวิจัยแห่งชาติ ในการทดลองเพาะเลี้ยงเซลล์ FS-L3 และทดสอบการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์ โดยการทดลองเพาะเลี้ยงและขยายเซลล์ให้ได้ปริมาณมาก ทดสอบการปนเปื้อนต่อเชื้อแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อต่อเชื้อ Mycoplasma spp. โดยวิธี Polymerase chain reaction (PCR) ทดสอบการปนเปื้อนต่อเชื้อไวรัสในสุกรโดยการย้อมเซลล์ด้วยสารวินิจฉัยที่ จำเพาะต่อเชื้อไวรัสในสุกรแต่ละชนิด เช่น การใช้ฟลูออเรสเซนต์ คอนจูเกตต่อเชื้อไวรัสอหิวาต์สุกร ไวรัสโรคพิษสุนัขบ้าเทียม (Pseudorabies) ไวรัส bovine viral diarrhea ไวรัสไข้สมองอักเสบ Japanese B encephalitis พาร์โวไวรรัสในสุกร (Porcine parvovirus) ไวรัส Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) และไวรัส enecphalomyelocarditis การทดสอบ media ที่เหมาะสมสำหรับการเจริญเติบโตของเชื้อไวรัสวัคซีนสเตรน GPE ในเซลล์ไลน์ FS - L3 โดยการทดสอบการเจริญเติบโตของเชื้อ GDE ใน media ที่มีซีรัม 0,1, 3, 5 และ 10% เก็บเชื้อไวรรัสหลังเพาะเชื้อ 7 วัน นำไปหาปริมาณของเชื้อไวรัส ทดสอบความเป็นกรดด่าง (pH) ที่เหมาะสมโดยการใช้ปริมาณซีรัมคงที่ แต่ปรับ pH ของ media ที่ปรับสภาพความเป็นกรดด่างและปริมาณซีรัมที่เชื้อไวรัสเจริญได้สูงสุด ทดสอบหาปริมาณของเชื้อไวรัสวัคซีน ที่เหมาะสมในการเพาะเลี้ยงในเซลล์ FS - L3 โดยการเปรียบเทียบการเจริญของเชื้อไวรัสที่มีความเข้มข้นต่างๆ กัน โดยใช้เชื้อไวรัส 0.01 MOI และ 1 MOI เพาะเลี้ยงเซลล์ FS-L3 โดยเลือก media ที่ได้ทดสอบความเหมาะสมของการเจริญของเชื้อไวรัสแล้ว เก็บไวรัสวัคซีนทุกวันนำมาหาปริมาณของเชื้อไวรัสเปรียบเทียบการเจริญของ เชื้อไวรัส เลือกใช้ปริมาณเชื้อไวรัสและระยะเวลาการเก็บวัคซีนที่เหมาะสม เพื่อให้ได้ปริมาณเชื้อไวรัสสูงสุด โดยคำนึงถึงต้นทุนการผลิต เตรียม master seed ของเชื้อไวรัสวัคซีน โดยใช้ seed ดั้งเดิมจากประเทศญี่ปุ่น (2515) นำมาเพาะเลี้ยงผ่านเซลล์ไตหนูตะเภาชนิดปฐมภูมิ 1 ครั้ง แล้วนำมาเพาะเลี้ยงในเซลล์ FS-L3 อบที่อุณภูมิ 30-31๐C เป็นเวลา 7 วัน เก็บเชื้อไวรัสวัคซีนหาปริมาณเชื้อไวรัสทดสอบการปนเปื้อนแจกไส่ขวดเก็บที่ -70 ๐C เป็น master seed ทดลองวัคซีนชุดเล็ก 100-500 โด๊สต่อชุด โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ FS-L3 ให้เต็มผิวขวดเพาะเซลล์ นำ master seed มาเจือจางให้ได้ปริมาณเชื้อไวรัส ที่เหมาะสมแล้วเพาะเลี้ยงในเซลล์ นำปอบที่อุณหภูมอ 30-31 ๐C นาน 7 วัน เก็บวัคซีน (media ที่มีเชื้อไวรัสวัคซีน) หาปริมาณของเชื้อไวรัสทดสอบในวัคซีน เข้าเครื่องดูดแห้งนาน 24 ชั่วโมง และเก็บวัคซีนชนิดดูดแห้งที่อุณหภูมิ 2-5 ๐C ทดสอบคุณภาพของวัคซีนทางห้องปฏิบัติการ คุณสมบัติทั่วๆ ไป คุณลักษณะภายนอก (property test) ความเป็นสุญญากาศ (vaccum test) ความชื้น (moisture test) ทดสอบอายุการเก็บวัคซีนชนิดดูดแห้ง โดยนำวัคซีนชนิดที่เก็บไว้ที่ 2-5 ๐C หาปริมาณเชื้อไวรัสววัคซีนทุกเดือน การทดสอบวัคซีนในสุกรทดลอง การทดสอบความโรคของวัคซีน (potency test) ใช้สุกรทดลองที่ไม่มีภูมิคุ้มกันต่อเชื้ออหิวาต์สุกร จำนวน 6 ตัว ฉีดวัคซีนขนาดโด๊ส ปกติต่อตัวแก่สุกร จำนวน 5 ตัว สุกรควบคุมจำนวน 1 ตัว ฉีดอาหารเลี้ยงเซลล์ วัดอุณหภูมิร่างกายทุกวัน เป็นเวลา 14 วัน เจาะเลือดหลังฉีดวัคซีน 3, 7, 10, และ 14 วัน เพื่อตรวจหาไวรัสวัคซีนในซีรัมและหาระดับแอนติบอดี ฉีดพิษทับด้วยเชื้ออหิวาต์สุกรชนิดรุนแรงเสตรนที่ใช้ในการทดสอบประสิทธิภาพ ของวัคซีนของกรมปศุสัตว์ (Bangkok 1950) ขนาด 105 PLD50 แบบ (50% pig lethal dose) วัดอุณหภูมิและสังเกตอาการ เป็นเวลา 3 สัปดาห์ เจาะเลือดหลังจากฉีดเชื้อพิษทับ 3, 7, 10, 14 และ 21 วัน เพื่อหาปริมาณไวรัสที่เป็นเชื้อพิษ และหาระดับแอนติบอดี หลังฉีดเชื้อพิษ 21 วัน ทำการฆ่าสุกรทุกตัว เก็บตัวอย่างอวัยวะภายใน (ต่อมน้ำเหลือง ทอนซิล สมอง ตับ ปอด ม้าม ไต และลำไส้) นำมาตรวจหาปริมาณของเชื้อไวรัส และตรวจทางพยาธิวิทยา การทดสอบหา pig pretective dose (PD50 ) ของวัคซีนใช้สุกรทดลองที่ไม่มีแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสอหิวาต์สุกร อายุ 5 สัปดาห์ จำนวน 22 ตัว แบ่งเป็น 7 กลุ่มๆ ละ 2-4 ตัว นำวัคซีนชนิดแห้งชุดที่ 1 ขนาดโด๊สปกติ และวัคซีนที่เจือจางเป็น 10 เท่า (10-1) 100 เท่า (10-2) 1,000 เท่า(10-4) 10,000 เท่า (10-5) นำมาฉีดสุกรดังนี้กลุ่มที่ฉีดวัคซีนโด๊สปกติใช้สุกร 2 ตัว ฉีดวัคซีน 1 โด๊สต่อตัว กลุ่มที่มีฉียดวัคซีนที่เจือจาง ใช้สุกร กลุ่มละ 2-4 ตัว ฉีดตตัวละ 1 มิลลิลิตร และกลุ่มควบคุมจำนวน 2 ตัว ฉีดอาหารเลี้ยงเซลล์ตัวละ 1 มิลลิลิตร วัดอุณหภูมิร่างกายทุกวันเป็นเวลา 14 วัน ฉีดเชื้อพิษทับด้วยเชื้อไวรัสอหิวาต์สุกรชนิดรุนแรง (Bangkok 1950) ขนาด 105 PLD50 ต่อตัว วัดอุณหภูมิร่างกาย สังเกตอาการทุกวัน และเจาะเลือดในวันที่ 3, 7, 10 และ 14 วันหลังฉีดเชื้อพิษทับ ตรวจภาวะ leukopenia แยกเชื้อไวรัสที่เป็นเชื้อพิษและหาระดับแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสอหิวาต์สุกร ทำการผ่าซากสุกรในวันที่ 14 หลังฉีดเชื้อพิษทับเพื่อแยกไวรัสที่เป็นเชื้อพิษจากตัวอย่างอวัยวะภายใน สุกรที่มีภูมิคุ้มโรคจะไม่ตายและตรวจไม่พบเชื้อไวรัส จากอวัยวะภายใน 10-14 วัน และจะตรวจพบเชื้อไวรัสที่เป็นเชื้อพิษจากเลือดและตัวอย่างอวัยวะภายใน คำนวณหา PD50 อัตราการตายของสุกรโดยวิธี Reed and Muench (1935) การทดสอบความปลอดภัยและการแพร่เชื้อไวรัสวัคซีน (safety test and cohabitation infection test) ใช้สุกรทดลองอายุ 5 สัปดาห์ จำนวน 6 ตัว ฉีดวัคซีน ขนาด 10 เท่าของโด๊ส ปกติจำนวน 4 ตว หลังฉีดวัคซีน นำสุกรกลุ่มควบคุมจำนวน 2 ตัว มาเลี้ยงรวมกัน วัดอุณหภูมิและสังเกตอาการทุวันเป็นเวลา 2 สัปดาห์ สุกรทุกตัวต้องเป็นปกติ และไม่มีการแพ้วัคซีนเจาะเลือดสุกรหลังฉีดวัคซีน 3, 7, 10 และ 14 วัน เพื่อหาปริมาณของเชื้อไวรัรสวัคซีนและหาระดับแอนติบอดี ทำการผ่าซากสุกรและเก็บตัวอย่างอวัยวะภายในสุกรทุกตัวในวันที่ 14 หลังฉีดวัคซีนนำไปแยกเชื้อพิษสุกรควบคุมในวันที่ 14 หลังฉีดวัคซีนการหาระยะภูมิคุ้มโรคของวัคซีน (duration of immunity) ใช้สุกรทดลองที่ไม่มีแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสอหิวาต์สุกรอายุ 5-6 สัปดาห์จำนนวน 16 ตัว ฉีดวัคซีนโดยใช้วัคซีนชนิดแห้ง ชุดที่ 1 โด๊สปกติต่อตัว เจาะเลือดก่อนฉีดวัคซีน และหลังฉีดวัคซีนทุกเดือนๆ ละ 1 ครั้ง เพื่อตรวจหาระดับแอนติบอดีแบ่งสุกรที่ฉีดวัคซีนจำนวน 2 ตัว พร้อมสุกรควบคุม 1 ตัว นำมาฉีดพิษทับด้วยเชื้อไวรัสอหิวาต์สุกรชนิดรุนแรง (Bangkok 1950) ขนาด 105 PLD50 ต่อตัว ทุกๆ 3 เดือน เพื่อตรวจความคุ้มโรคของวัคซีนสุกร ที่มีภูมิคุ้มโรคของวัคซีน สุกรที่มีภูมิคุ้มกันโรคของวัคซีน สุกรที่มีภูมิคุ้มกันโรคจะไม่ตาย และตรวจไม่พบเชื้อไวรัสที่เป็นเชื้อพิษในเลือดและอวัยวะภายใน การทดสอบความคงที่ (Stability) ของเชื้อไวรัสวัคซีนผ่านเชื้อไวรัสวัคซีนในเซลล์ FS-L 3 ที่อุณหภูมิ 30 ๐C จำนวน 50 passage นำเชื้อไวรัสที่ผ่านเซลล์ FS -L3 passage มาฉีดสุกรทดลองจำนวน 4 ตัวมีกลุ่มควบคุมที่ฉีดวัคซีที่ผ่าน FS - L3 passage แรก 2 ตัว สังเกตอาการ วัดอุณหภูมิร่งกายทุกวัน หลังฉีดเชื้อไวรัสวัคซีน 3, 7, 10 และ 14 วัน ทำการเจาะเลือดเพื่อตรวจจำนวนเม็ดเลือดขาว แยกเชื้อไวรัสวัคซีนจากซีรัม ทำการผ่าซากสุกรทุกตัวในวันที่ 14 หลังฉีดเชื้อไวรัสวัคซีนและเก็บตัวอวัยวะภายใน นำไปตรวจหาปริมาณของเชื้อไวรัส และตรวจทางจุลพยาธิวิทยา ฉีดวัคซีนผ่านสุกรทดลองต่อเนื่องจำนวน 4 passage โดยนำตัวอย่างเลือด ซีรัมและอวัยวะภายในสุกรทดลองที่ฉีดวัคซีน นำไปฉีดเข้าสุกรทดลองต่อๆ ไป จำนวน 4 passagge สังเกตอาการ และวัดอุณหภูมิทุกวัน เก็บตัวอย่างอวัยวะภายในสุกุรทุกตัว เพื่อนำไปแยกเชื้อไวรัสวัคซีน และตรวจทางพยาธิวิทยา เชื้อไวรัสวัคซีนที่มีความคงที่ (stable) เมื่อผ่านเซลล์เพาะเลี้ยงหรือผ่านสุกรต่อเนื่อง จะไม่ทำให้เชื้อไวรัสวัคซีนกลับมารุนแรงทำให้เกิดโรคในสุกรได้ โดยจะไม่พบสุกรแสดงอาการของโรคหรือตาย และตรวจไม่พบภาวะเม็ดเลือดขาวต่ำหรือพบเชื้อไวรัสในเลือด
จากการทดลองผลิตวัคซีนอหิวาต์สุกร ชนิดเซลล์เพาะเลี้ยงโดยใช้เซลล์ FS - L3 และเชื้อไวรัสและเชื้อไวรัสวัคซีนเสตรน GDE ที่ได้พัฒนาในครั้งนี้ สามารถนำไปผลิตเป็นวัคซีนซึ่งมีคุณภาพ ความปลอดภัยและมีประสิทธิภาพในการให้ความคุ้มโรคสูงใกล้เคียงกับวัคซีนที่ ผลิตโดยใช้เซลล์ไตหนูตะเภาที่ผลิตในประเทศยี่ปุ่นหรือที่เคยผลิตในประเทศไทย จากผลการวิจัยสรุปได้ดังนี้ การเพาะเลี้ยงเซลล์ให้ได้ปริมาณมากที่สุด ใช้อัตราส่วนนาการเพาะเลี้ยงเซลล์ 1:4 เซลล์จะเจริญเต็มผิวขวดเพาะเซลล์ภายใน 3-4 วัน ใช้เชื้อไวรัสวัคซีนขนาด 0.1 MOI ใน bacto peptone meduim ซึ่งมีส่วนประกอบของซีรัมโค 5 % (ปลอดจากแอนติบอดีต่อเชื้อ Bovine viral diarrhea virus) ปรับความเป็นกรดด่างที่ pH ระหว่าง 7.0-7.2 นำไปเพาะเลี้ยงในตู้อบ 30 ๐C เก็บเชื้อไวรัสวัคซีนในวันี่ 7 หลังเพาะเลี้ยงเชื้อไวรัส การทำแห้งวัคซีนใช้ stabilizer ที่มีส่วนประกอบของ lactose 10% และ polyvinyl pyrolidone K 900.3% ในอัตราส่วน 1:1 วัคซีนปริมาณเชื้อไวรัส 4.3-4.8 log TCID50 ต่อโด๊ส วัคซีนชนิดดูดแห้งทั้ง 3 ชุด ทดสอบผ่านมาตรฐานการทดสอบทางห้องปฏิบัติการ สามารถเก็บไว้ในตู้เย็นปกติ (2-5 ๐C) ได้นานกว่า 18 เดือน วัคซีนมีความปลอดภัยสูงไม่แพร่เชื้อไวรัสวัคซีนในสุกรทดลองพบว่าวัคซีนให้ความคุ้มโรคสูง และคงอยู่ได้นานไม่น้อยกว่า 1 ปี เชื้อไวรัสวัคซีนมีความคงที่ได้ด้านการอ่อนความรุนแรง โดยไม่กลับมารุนแรงในสุกรหลังการทดสอบ โดยการฉีดผ่านสุกรติดต่อกัน 4 ครั้ง วิธีผลิตระดับอุตสาหกรรม ทดแทนการผลิตวัคซีนชนิดเดิมที่ใช้กระต่ายในการผลิต


|หน้าแรก| แผนผังเว็บ| ข้อมูลองค์กร| การบริการ| องค์ความรู้| พัฒนาองค์กร| แผนงาน-วิจัย| บริหารจัดการ| พัสดุ-งบประมาณ| สถิติ-รายงาน| ติดต่อ| English|
Home องค์ความรู้ การจัดการองค์ความรู้ การพัฒนาวิธีผลิตวัคซีนอหิวาต์สุกรโดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยง